Skip to content

Kamica moczowa i hepatotoksyczność są związane z transporterem anionowym Sat1 u myszy ad 5

1 miesiąc ago

458 words

PCR przeprowadzono przy użyciu startera P4 w kasecie genowej neoR i antysensownego primera P5 w dół od eksonu 4. Badania przeprowadzono na samcach myszy o mieszanym podłożu genetycznym (129JSv i CD1). Myszy utrzymywano w 12-godzinnym cyklu światło / ciemność i karmiono ad libitum na standardowej karmie dla gryzoni (dieta nr AIN93G, Glen Forrest Stockfeeders). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Biosciences Uniwersytetu Queensland. Genotypowanie myszy. Myszy genotypowano przy użyciu startera P1 w intronie 2 i antysensownego startera P3 w kasecie genowej neoR do PCR amplifikuje fragment 0,4-kb rekombinowanego allelu Sat1 (Tabela uzupełniająca i Figura 1A). Starter P1 i antysensowny starter P2 w eksonie 3 zastosowano do amplifikacji fragmentu 0,5-kb allelu Sat1 typu dzikiego (tabela dodatkowa i figura 1A). Parametry cyklu były następujące: 95 ° C przez 10 sekund, a następnie 35 cykli w 95 ° C przez 10 sekund, 58 ° C przez 30 sekund i 68 ° C przez 3 minuty. Analiza RNA. Całkowity RNA (10 .g) rozdzielono na 1,2% żelu agarozowo-formaldehydowym w buforze MOPS i przeniesiono na membrany nylonowe Hybond-XL (Amersham). Bloty sondowano cDNA Sat1 1,4 kb i mysią cDNA GAPDH 0,6 kb. W przypadku RT-PCR całkowite RNA (2 ug) poddano odwrotnej transkrypcji przy użyciu losowych heksamerów i odwrotnej transkryptazy wirusa Moloney Mine białaczkę (Progen), zgodnie z zaleceniami producenta. Starter P8 w eksonie 2 i antysensowny starter P9 w eksonie 4 (figura 2A i tabela dodatkowa 1) zastosowano do amplifikacji fragmentów cDNA Sat1. CDNA GAPDH poddano amplifikacji RT-PCR przy użyciu ustalonych sekwencji starterów (17). Przygotowanie pęcherzyków błony, badania transportowe i Western blotting. BLMV i BBMV wyizolowano z nerki myszy, wątroby i jelit przy użyciu wcześniej opisanych metod (29, 30). Pęcherzyki inkubowano wstępnie w buforze zawierającym 120 mM glukonian potasu, 30 mM KCl i 15 mM HEPES o pH 8,2 przez 2 godziny w 20 ° C. Wykorzystanie SO42. (0,1 mM) i szczawian (20 .M), każdy przeprowadzony w czterech powtórzeniach, mierzono w 10 sekundach (SO42) i 30 sekundach (szczawian) w pożywce zawierającej 150 mM glukonianu potasu i 15 mM HEPES, pH 8,2, w szybkim tempie. technika filtracji (23, 31). Białko BLMV (5 ug) rozdzielono na 10% żelu poliakrylamidowym SDS i przeniesiono na membranę nylonową (membrana Immobilon-FL, Millipore). Białka Sat1 wykryto przeciwciałem Sat1 (5) dostarczonym przez LP Karniski (University of Iowa, Iowa City), z wyznakowanym IRDye CW800 anty-mysim IgG (rozcieńczonym 1: 20 000) i systemem obrazowania Odyssey (LI-COR Biotechnology) . Wszystkie eksperymenty powtarzano co najmniej dwa razy. Analizy biochemiczne. Krew mysią pobierano z żyły podżuchwowej przy użyciu nakłuwacza do nakłuwania zwierząt (MEDIpoint Inc.). Próbki moczu pobrano pojedynczo podczas spontanicznej mikcji podczas obsługi myszy przed pobraniem krwi. Do pomiaru wolnych poziomów siarczanu użyto testu turbidymetrycznego (17). Szczawian mierzono za pomocą chromatografii jonowej z tłumioną detekcją przewodnictwa z użyciem Dionex ICS2000 z Chromeleonem 6,80 (32,33). Po zebraniu 100 .l surowicy i moczu szybko dodano 10 .l HCl (8M), a próbki zamrożono w temperaturze <80 ° C, aby zapobiec strącaniu szczawianu i oksalfezy. Poziomy kreatyniny w surowicy i moczu oznaczono ilościowo enzymatycznie za pomocą analizatora chemicznego Vitros 5.1 FS (Diagnostyka orto-kliniczna). Stężenie PO42a, Na +, K +, Cl3, Ca2 + i ALT badano w komercyjnym laboratorium patologicznym (Sullivan Nicolaides Pathology), stosując analizator chemiczny Vitros 250 (Ortho-Clinical Diagnostics). Poziom glikolanu w moczu oznaczono ilościowo stosując Agilent 6890 GC i 5973A MSD z MSD Chemstation B.01.00. Całkowite poziomy białka w moczu oznaczono ilościowo przy użyciu zestawu do mikromacierzy białkowych (BioRad). PH krwi pełnej i moczu mierzono za pomocą miernika pH ISFET (Shindengen). W wątrobie poziom GSH oznaczano stosując dostępny w handlu zestaw (Cayman Chemical Co.). Zawartość H2O w próbkach stolca określono przez zważenie próbek przed i po ich wysuszeniu pod próżnią przez 30 godzin w temperaturze 25 ° C. Aktywność nerek i wątroby IDUA mierzono za pomocą testu fluorometrycznego (34). Analiza histopatologiczna. Tkanki wycięto na około 50 objętości 10% zbuforowanej formaliny i utrwalono na 3 dni przed zatopieniem w parafinie. Osadzoną tkankę podzielono, zabarwiono H & E lub metodą histochemiczną Yasue (35) w celu wykrycia kryształów szczawianu wapnia i zbadano pod mikroskopem optycznym. Sekcje wątroby oceniano jako nielepione na genotyp pod kątem nasilenia zwyrodnienia i martwicy przy użyciu skali 0. 5, jak opisano wcześniej (36). Administracja APAP APAP (Sigma-Aldrich) rozpuszczono w soli fizjologicznej i wyjałowiono przez sączenie. W wieku około 3 miesięcy myszy otrzymały iniekcję ip dawki 250 mg / kg APAP (n = 4. 8 na grupę). Myszy uśmiercono w 2 lub 12 godzin po podaniu APAP. Statystyka. Istotność statystyczna między Sat1 + / + i Sat1. /. lub Sat1 + /. grupy oceniano stosując niesparowany test t-Studenta 2-tailed. Istotność statystyczna między Sat1 + / + i Sat1. /. grupy z odpowiednimi kontrolami w punkcie czasowym 0 oceniano stosując 1-sposób ANOVA, a następnie test wielokrotnego zasięgu Duncana. Różnice w wynikach histologii analizowano za pomocą testu Manna-Whitneya. We wszystkich przypadkach wartość P mniejsza niż 0,05 została uznana za istotną. Materiały uzupełniające Zobacz dodatkowe dane Podziękowania Podziękowania dla S. Gibsona, K. Colobonga, P. Addisona, I. Wilkie i I. Shielsa za pomoc naukową. LA Clarke otrzymuje nagrodę za badania naukowe za pośrednictwem Instytutu Badań nad Rodziną i Rodziną. Prace te były częściowo wspierane przez Australian Research Council oraz National Health and Medical Research Council. Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Cytat za ten artykuł: J Clin Invest. 2010; 120 (3): 706. 712. doi: 10,1172 / JCI31474. [podobne: obliczanie wskaźnika bmi, przedszkole strumień, olza pogwizdów ] [hasła pokrewne: strażak pielgrzymowice, lks strażak pielgrzymowice, wisła strumień ]