Skip to content

Komórki mielomonocytowe hematopoetyczne są głównym źródłem partnerów fuzji hepatocytów ad 5

2 miesiące ago

770 words

Louis, Missouri, USA) i inkubacje przeciwciał przeprowadzono jak opisano wcześniej (29). Bramki sortujące dla pojedynczych komórek ustawiono na najniższej części ogona SP, wykazując, że zawierają one najbardziej prymitywne HSC (30), tak że wybrano tylko 10% komórek SP. Komórki SP, które były podwójnie pozytywne pod względem Sca-1 i CD45, sortowano następnie na urządzeniu z potrójnym laserem (MoFlo; Cytomation Inc., Fort Collins, Colorado, USA). Pojedyncze komórki sortowano bezpośrednio do pojedynczych studzienek płaskodennej 96-studzienkowej płytki zawierającej 150 ul buforu StemPro (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) przez jednostkę do osadzania pojedynczych komórek. Przeszczepianie i analiza HSC i WBM. Myszy CD45.1 C57BL / 6 w wieku od 5 do 6 tygodni były naświetlane letalnie 10 Gy w napromienienie w dawce podzielonej, z 3 godzinami pomiędzy dawkami. Odtworzone komórki wstrzyknięto retro-orbitalnie w ciągu 24 godzin po napromieniowaniu. Aby zmaksymalizować odzysk pojedynczych komórek ze studzienek, najpierw zasysano zawartość każdej studzienki, a następnie przemywano taką samą studzienką 150 ul buforu zawierającego odpowiednią liczbę nietransgenicznych komórek nośnikowych CD45.1 C57BL / 6 (3. albo 1. 105 komórek WBM pozbawionych komórek cKit + Sca-1 + podwójnie dodatnich (w dwóch eksperymentach) lub 600 komórek Lin. Sca-1 + cKit + CD34high (w jednym eksperymencie). Objętość w studzience następnie ponownie aspirowano i wstrzykiwano. Komórki nośnikowe, wyizolowane przy użyciu dwóch parametrów opisanych powyżej, są wysoce pozbawione długotrwałej aktywności HSC, a ich żywotność in vivo wynosi od 4 do 8 tygodni (31). Myszy przebadano pod kątem przeszczepienia krwiotwórczego w różnych punktach czasowych rozpoczynających się po 2 miesiącach po transplantacji. W przypadku transplantacji do wtórnych biorców, BM od dwóch pierwotnych biorców HSC był zbierany i barwiony przeciwciałami przeciwko CD45.2-FITC (klon 104, Pharmingen, San Diego, Kalifornia, USA) i CD45.1-fikoerytryna (CD45.1- PE) (klon A20). Około 18. 106 komórek CD45.2 + od każdej myszy zostały następnie posortowane, podzielone na dwie części i wstrzyknięte do letalnie napromienionych biorców. Poziomy hematopoetycznego chimeryzmu testowano przez barwienie leukocytów krwi obwodowej biorców w różnych punktach czasowych z CD45.2-FITC i CD45.1-PE. W celu określenia udziału krwiotwórczych linii komórkowych, leukocyty krwi obwodowej wybarwiono anty-CD45.2-FITC i przeciwciałami przeciw CD3 (145-2C11), Thy-1 (30-H12), B220 (RA3-6B2), Gr-1 ( RB6-28C5) i Mac-1 (M1 / 70). Wszystkie przeciwciała linii zostały bezpośrednio skoniugowane z FITC lub PE-Cy5 i zakupione z eBioscience (San Diego, Kalifornia, USA). Analizę aktywności (3-galu w komórkach krwiotwórczych myszy LysM-Cre / R26R przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (32). Modele urazów tkanek. Uszkodzenie wątroby u myszy z przeszczepionymi pojedynczymi komórkami Rosa26 indukowano przez dodanie do zwierząt DDC (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). karmić w stężeniu 0,1% przez 20 dni w 6 miesięcy po transplantacji. Immunohistologia wątroby. W przypadku barwienia X-gal na całym wierzchu, płaty wątrobowe utrwalano przez 2 godziny w 4% paraformaldehydzie, a tkanki przemywano PBS i przenoszono do podłoża do barwienia zawierającego mg / ml X-gal w buforze o stężeniu 5 mmol / lK żelazicyjanek, żelazocyjanek 5 mmol / lK, 2 mmol / l MgCl2, 0,02% Nonidet P-40 i 40 mmol / l HEPES. Barwienie X-gal zamrożonych próbek wątroby przeprowadzono jak opisano poprzednio (33) na 10-.m przekrojach. Skrawki następnie barwiono kontrastowo światłem H & E lub elektrolitycznie szybko czerwoną. W przypadku immunohistochemii FAH wątrobę utrwalono w 10% obojętnej buforowanej formalinie, zatopiono w parafinie i podzielono na 4 .m. Barwienie FAH przy użyciu poliklonalnego króliczego przeciwciała przeciw szczurzemu FAH przeprowadzono zgodnie z opisem (34). W celu ilościowego oznaczenia hepatocytów pochodzących od dawców u pierwotnych biorców analizowano 20 losowych przekrojów z różnych płatów wątroby i podawano liczbę komórek dodatnich (duże komórki y-gal + z obfitą cytoplazmą) na całkowitą liczbę hepatocytów na szkiełkach (to oszacowanie). była oparta na średnio 1600 hepatocytów na milimetr kwadratowy tkanki wątroby myszy). Pomiary biochemiczne. Poziomy aminokwasów określono za pomocą analizatora aminokwasów Beckman model 6300. PodziękowaniaM.A. Goodell jest uczonym w Towarzystwie Białaczki i Chłoniaków. Ta praca została wsparta przez NIH przyznaje DK58192 i CA81179 do MA Goodell. FD Camargo był członkiem American Liver Foundation. Dziękujemy Markusowi Grompe (Oregon Health Sciences Centre) za prezent dla myszy FAH, Lily Pao (Harvard Medical School) dla myszy LysM-Cre, Angela Major dla immunohistochemii i Dorothy Burton za wyjątkową opiekę nad zwierzętami Przypisy Patrz odnośny komentarz od strony 1249. Niestandardowa lista skrótów: szpik kostny (BM); 3,5-dietoksykarbonylo-1,4-dihydrokolidyna (DDC); hydrolaza fumaryloacetooctanu (FAH); hematopoetyczna komórka macierzysta (HSC); lizozym-M (LysM); 2- (2-nitro-4-trifluorometylobenzol) -1,3-cykloheksanodion (NTBC); fikoerytryna (PE); populacja boczna (SP); cały BM (WBM). Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.
[więcej w: strażak pielgrzymowice, olza pogwizdów, nalewka z aronii liście wiśni ]
[patrz też: arbuz indeks glikemiczny, odklejenie siatkówki oka, obliczanie wskaźnika bmi ]