Skip to content

Lentivector, w którym pośredniczy SMN w mysim modelu zaniku mięśni kręgosłupa ad 5

2 tygodnie ago

849 words

Uważamy, że takie podejście może potencjalnie stanowić bezpieczne i praktyczne leczenie wielu objawów motorycznych ludzkiego SMA. Metody Wirusowa produkcja. Autobiagnozujące się samoloty wektorowe EIAV skonstruowano z wcześniej opisanych wektorów pONY8.0Z lub pONY8.0G (10, 24). CDNA kodujący gen reporterowy LacZ lub ludzki SMN został sklonowany w wektorze transferowym EIAV. Wytworzono genom wektora EIAV, który koduje gen SMN z lub bez znacznika HA. Zapasy wektorów wirusowych pseudotypowane z glikoproteiną G wścieklizny zostały przygotowane przy użyciu układu przejściowego HEK293T, jak opisano wcześniej (10, 25). Miana (w przybliżeniu 4 x 109 TU / ml) stężonych wektorów wirusowych EIAV-LacZ oszacowano przez transdukcję komórek D17. Miana (4 x 109 do 7 x 109 TU / ml) wektorów EIAV-SMN lub EIAV-EIAV-SMN-HA oszacowano za pomocą ilościowego RT-PCR w czasie rzeczywistym przez porównanie z wektorami EIAV-LacZ i znormalizowano dla wirusa. RNA (26, 27). Transdukcja in vitro. Fibroblasty GM03813 od pacjenta z SMA typu (Coreill Cell Repository) transdukowano wektorami EIAV-SMN, EIAV-SMN-HA lub EIAV-LacZ pseudotypowanymi kopertą Wścieklizny-G (ERAwt) przy MOI 20 i 100, odpowiednio, w obecności 8 .g / ml polibrenu (25). W 7 dni po transdukcji komórki utrwalono w 4% paraformaldehydzie. Ekspresja SMN była monitorowana przy użyciu Abs przeciwko znacznikowi SMN i HA. Histologia i immunohistochemia. Zwierzęta perfundowano przezsercowo 0,9% roztworem NaCl, a następnie lodowato zimnym 4% paraformaldehydem. Usunięto rdzeń kręgowy, mózg i tkanki mięśniowe, dodawano przez noc do tego samego roztworu, a następnie przeniesiono do 30% sacharozy. Tkanki analizowano za pomocą immunohistochemii i reakcji X-gal. Rdzeń kręgowy i tkankę mózgową pocięto na przesuwnym mikrotomie kriostatu (Leica) o grubości 20 urn i zebrano jako swobodne sekcje w PBS zawierającym azydek sodu. Pierwotne Ab zastosowano w następujący sposób: mysi anty-HA (1: 100; Roche Diagnostics); mysie anty-SMN (1: 1000; Laboratoria Transdukcji); królicze przeciwciało – gal (1: 1,000, Cortex Biochem Inc.); króliczego anty-CGRP (1: 3 000, Sigma-Aldrich); mysz anty-ChAT (1: 1000, prezent od BK Hartman i C. Cozari, University of Minnesota, Minneapolis, Minnesota, USA); Komórki CD3-T (1:50; Dako Corp.); i P7 / 7-MHCII (1: 100; Dako Corp.). Model zwierzęcy SMA. Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych. Model myszy SMA zastosowany w bieżącym badaniu został wygenerowany przez Le i współpracowników (13). Pokrótce, cDNA SMN bez egzonu 7 umieszczono pod kontrolą fragmentu promotora SMN o wielkości 3,4 kb (transgen określany jako SMN a7) i mikroiniekowano na zapłodnione oocyty mysie (FVB / N). Wszystkie linie miały wiele kopii transgenu, jak określono metodą PCR w czasie rzeczywistym. Transgeniczne myszy SMNP7 krzyżowano z myszami zawierającymi SMN2 i mysi allel Smn KO (8), aby otrzymać myszy podwójnie transgeniczne SMNy7 SMN2 Smn + / r. na tle FVB / N krzyżowanym wstecznie przez 6 pokoleń. Te myszy transgeniczne były krzyżowane w celu uzyskania Smn2 /. myszy z SMN2 i SMN . 7. Smn. /. Myszy SMN2 niosące 2 kopie transgenów SMN2 przeżywają średnio 5,16 dnia po urodzeniu (9). Stwierdzono, że SMN7 7 przedłuża przeżycie Smn. /. Myszy SMN2 od 5,16. Od 0,24 do 13,27. 0,34 dnia (13). Dostarczanie domięśniowe. Pseudotypowane wektory lentiwirusowe z Wścieklizną G niosące ludzki gen SMN lub LacZ wstrzyknięto obustronnie w tylną kończynę (30 ul), twarz (10. L), przeponę (20. L), mięśnie międzyżebrowe (10. L) i mięśnie języka ( 5 ul) myszy transgenicznych SMA w P2. Wektory Lentivector-SMN lub Lentivector-LacZ wstrzyknięto obustronnie do mięśni brzucha, mięśni przeponowych, mięśni międzyżebrowych, twarzy i języka myszy tylnych kończyn, SMA, w wieku 2 dni. Każdy mięsień otrzymał pojedyncze zastrzyki do wielu miejsc. Pierwsza grupa myszy SMA otrzymała iniekcje EIAV-SMN (n = 5) w P2. Inna grupa zwierząt z SMA była leczona wektorem EIAV-LacZ (n = 5). Nieleczone myszy SMA również zostały włączone do niniejszego badania (n = 5). Zastrzyki zostały wykonane przez operatora, który nie był zaangażowany w dalsze badania zwierząt. Liczba komórek. Wszystkie liczby komórek zostały ocenione jako ślepe przez 2 niezależnych obserwatorów. W skrócie, liczba transdukowanych komórek była zliczana w co piątej sekcji w całym odcinku lędźwiowym rdzenia kręgowego i jądrze twarzowym. Zliczenia przeprowadzono przy powiększeniu x 40. Współczynnik błędu określono w sposób opisany wcześniej przez Abercrombie (28). Analiza statystyczna. Dane wyrażono jako średnią. SEM, i analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA dla porównania między grupami leczenia Poziom istotności ustalono przy wartościach P mniejszych niż 0,05. PodziękowaniaTo dzieło zostało wsparte przez Oxford BioMedica i grant od Andrews Buddies / FightSMA. Grant 38650 NIH wspiera T. Le i kolonię zwierząt stosowaną w bieżącym badaniu. Footnotes Obecny adres Lucy Walmsley to: Oxxon Pharmaccines Ltd., Oxford, Wielka Brytania. Obecny adres Umrao R. Monani to: Department of Neurology, Columbia University, College of Physicians and Surgeons, New York, New York, USA. Zastosowano niestandardowe skróty: ALS, stwardnienie zanikowe boczne; CGRP, peptyd związany z genem kalcytoniny; ChAT, acetylotransferaza choliny; EIAV, wirus niedokrwistości zakaźnej koni; klejnoty, blizny zwiniętych ciał; MN, neuron ruchowy; SMA, rdzeniowy zanik mięśni; SMN, neuron ruchowy przeżycia. Konflikt interesów: M. Azzouz, GS Ralph, L. Walmsley, DCP Lee, F. Wilkes, KA Mitrophanous, SM Kingsman i ND Mazarakis posiadają akcje na Oxford BioMedica.
[patrz też: lks strażak pielgrzymowice, pogotowie dentystyczne olsztyn, strażak pielgrzymowice ]
[podobne: wisła strumień, lks pielgrzymowice, lks beskid brenna ]