Skip to content

Lentivector, w którym pośredniczy SMN w mysim modelu zaniku mięśni kręgosłupa ad

2 tygodnie ago

817 words

Transfer genów był specyficzny dla MN, ponieważ LacZ nie był wykrywalny w innych typach komórek (tj. Komórkach glejowych, komórkach naczyniowych). Transport powrotny wektora wirusowego sam został potwierdzony przez ilościowe doświadczenia PCR (Taqman) przy użyciu wycinków pobranych z obszaru jądra twarzy, ujawniając, że wirusowe DNA może być jedynie amplifikowane z tego obszaru po wścieklizny-G pseudotypowej transdukcji mięśnia twarzy EIAV (dane nie pokazane). Odkrycia te dodatkowo wskazują, że wektory EIAV-LacZ były rzeczywiście retrogradely transportowane z mięśnia wstrzykniętego ipsilateralnie do MN w rdzeniu kręgowym, gdzie transgen LacZ wyrażany był jednostronnie. Figura Transfer genu za pośrednictwem lientivera oparty na EIAV in vivo. Przekroje poprzeczne odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego (A), pnia mózgu (B i C) i mięśnia (D), wykazujące transdukcję zarówno mięśnia, jak i MN po wstrzyknięciu 30 .l wścieklizny G pseudotypowanego wektora lentivector-LacZ w brzuchatym macicy (A) i mięśnie twarzy (B i C) po urodzeniu myszy P2 FVB. (E) Liczba komórek całkowitych transdukowanych MN w rdzeniu lędźwiowym rdzenia kręgowego, jądrze twarzowym i jądrze trójdzielnym (MTN) po wstrzyknięciu domięśniowym lentivector-LacZ 2-dniowym myszom SMA. Dane to środki. SEM. Ekspresja. -Gal (zielony) (F) kolokalizuje z immunofluorescencją CGRP (czerwony) w rdzeniowych MN, wytwarzając żółte zabarwienie (G). Pręty skali: 400 .m (A i B), 200 .m (C i D), 100 .m (F i G). Lentivector-SMN odtwarza białko SMN w fibroblastach SMA typu 1. Białko SMN to 38-kDa, powszechnie wyrażane białko znajdujące się w cytoplazmie i jądrze (14, 15). W jądrze większości komórek SMN koncentruje się w strukturach nazywanych klejnotami, które często kolokalizują za pomocą zwiniętych ciał (16). W tkankach i komórkach od pacjentów z SMA typu I poziomy SMN są znacznie zmniejszone, a komórki mają niewiele lub nie mają klejnotów (15, 17). Skonstruowaliśmy lentivector (EIAV) wyrażający SMN lub HA-SMN znakowany epitopem (Figura 2A). Przed przeniesieniem genów in vivo u myszy SMA, testowaliśmy zdolność tych konstruktów do ekspresji SMN w linii komórkowej fibroblastów SMA typu I (Figura 2). Użyliśmy fibroblastów od pacjentów z SMA typu I, ponieważ komórki te wytwarzają bardzo mało klejów lub nie zawierają ich wcale (18). Wysokie poziomy białka SMN wykryto w fibroblastach, które inkubowano z Lentivector-SMN, to jest, że do 7 klejów na komórkę uzyskano w fibroblastach transdukowanych za pomocą Lentivector-SMN (Figura 2B). Liczby klejów ujawniły, że liczba klejów w transdukowanych komórkach Lentivector-SMN . była w przybliżeniu dwukrotnie większa niż obserwowana w normalnych fibroblastach (Figura 2J). Wykryto bardzo niewiele lub brak klejów w fibroblastach pochodzących od pacjentów z SMA indukowanych LacZ (fig. 2, C i J). Aby zademonstrować, że te struktury są rzeczywiście klejnotami, przeprowadziliśmy podwójne znakowanie SMN i innych białek zwykle związanych z klejnotami jądrowymi, takimi jak gemin2 (Figura 2, D. F). Western blots transdukowanych fibroblastów ujawniły również wysoki poziom SMN, gdy użyto konstruktu SMN (Figura 2K) w porównaniu z LacZ i komórkami pozorowanymi. Podsumowując, dane te wskazują na wysoką efektywność ekspresjonowania lentiwektorów SMN w celu przywrócenia klejów w fibroblastach pochodzących od pacjentów z SMA. Rycina 2 Za pośrednictwem mediatora przywrócono ekspresję białka SMN in vitro. (A) Schematyczne przedstawienie kodującego Lentivector dla ludzkiego genu SMN. CMV, cytomegalowirus; cPPT, centralny przewód polipurynowy; env, podwójnie usunięta koperta pozostawiająca tylko element odpowiedzi na rev; WPRE, element kontroli potranskrypcyjnej Woodchuck wirusa zapalenia wątroby typu; SIN, self-inactivating; LTR, powtórzenie na długim końcu. (B) Lentiwektorowa ekspresja SMN w fibroblastach od pacjentów z SMA typu I. Lentivector-SMN przywraca ekspresję SMN w klejach (strzałki). W fibroblastach inkubowanych z lentiwektorem-LacZ (C) nie zaobserwowano odbudowy klejnotów. Ekspresja SMN w ludzkich fibroblastach (zielony) (D) kolokalizuje z czerwoną immunofluorescencją geminy2 (E), powodując żółte zabarwienie (F). Strzałka wskazuje kolokację SMN z gemin2 w klejnotach. Lycivel-LacZ . traktowane fibroblasty barwione SMN Abs (G) i gemin2 (H). (I) Scalony obraz z G i H. (J) Gem liczy się w traktowanych przez Lentivector-SMNy i kontrolnych komórkach fibroblastów. (K) Immunoblot potwierdzający ekspresję SMN za pośrednictwem lentiwektora w ludzkich fibroblastach z użyciem przeciwciał przeciwko SMN. Pręty skali: 50 | jm (B i C), 100 | jm (Df), 200 | jm (Głi). Zastępstwo SMN za pośrednictwem lentivector u myszy SMA. Myszy SMA zastosowane w niniejszym badaniu wytworzono zgodnie z doniesieniami (13). Te myszy przeżywają średnio 13,27. 0,34 dni i wykazywały istotne różnice w wadze w 5 dniu życia. Model myszy SMA wyświetla utratę komórek MN w wieku 9 dni. W celu zbadania skuteczności przenoszenia genu SMN na przeżycie MN w modelu myszy SMA, wektory Lentivector-SMN lub Lentivector-LacZ wstrzyknięto obustronnie do mięśni brzucha łokciowej tylnej, przeponowej, międzyżebrowej, twarzy i języka myszy SMA o początku choroby 2 dni
[patrz też: rezonans magnetyczny poznan, olza pogwizdów, pierogi z mąki orkiszowej ]
[podobne: co oznacza sen o zdradzie, pełnia księżyca a samopoczucie, zajęcia sportowe dla dzieci ]