Skip to content

Receptor acetylocholiny mutacje podjednostek leżą u podstaw szybko-kanałowego zespołu miastenicznego i wieloogniskowej kongenity artrogrypozy ad

3 tygodnie ago

667 words

Startery oligonukleotydowe zaprojektowano do amplifikacji każdego z egzonów i ich odpowiednich granic intron / egzon. Typowa reakcja PCR obejmowała bufor reakcyjny [60 mM Tris-HCl, 15 mM (NH4) 2SO4, 1,5 <2,0 mM MgCl2 (pH 8,5); Invitrogen Corp., San Diego, Kalifornia, Stany Zjednoczone], każdy 1,25 .M startera, 200 .M dCTP, dGTP i dTTP, 0,075 .l [35S] dATPaS (> 1000 Ci / mmol; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway , New Jersey, USA), 50 .M dATP z około 50 ng genomowego DNA i 0,25 U polimerazy DNA Taq (PE Biosystems, Warrington, Cheshire, Wielka Brytania) w reakcji 5- (ll. Powstałe amplikony PCR analizowano za pomocą SSCP. Pary primerów 5. -TATGGCCCTACCGTCTAATTAC-3. i 5a -TCGGCCTTCCAAAGTGCTGG-3a i 5a-CTAAGATGTCCATGTGCCGC-3. i 5. -GGACGGGCCTGGAGGCTC-3. zostały użyte do amplifikacji AChR. podjednostki genu odpowiednio 3 i 7 egzonów. Amplikony wykazujące nieprawidłowe konformery oczyszczono z żeli agarozowych przy użyciu zestawu QIAquen QIAquick do ekstrakcji żeli (QIAGEN Inc., Valencia, Kalifornia, USA) i poddano bezpośredniemu sekwencjonowaniu DNA (urządzenie do sekwencjonowania DNA, Department of Biochemistry, Oxford University, United Kingdom ). Zmiany sekwencji DNA zostały potwierdzone przez PCR, a trawienie endonukleazami restrykcyjnymi przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. Konstrukcje ekspresyjne. cDNA kodujące AChR.,.,.,. i. podjednostki (12) subklonowano do pcDNA3.1 (Invitrogen Corp.). Mutagenne startery 5. -CAATGTGTGGATAAAGCACGGCTGGACAG-3. i 5. -GGTCTTCTACCTACCGGCTGACTGGTGAGAAGACATCAGTGGCC-3. zostały użyte do wprowadzenia mutacji A559K i A775del2 do AChR typu dzikiego. sekwencję podjednostek przy użyciu systemu ukierunkowanej mutagenezy ukierunkowanej in vitro GeneEditor (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA). Powstały. podjednostki cDNA sekwencjonowano w celu sprawdzenia obecności mutacji i braku jakichkolwiek dodatkowych zmian sekwencji. Badania ekspresji. Odpowiedni mutant. podjednostki cDNA, w połączeniu z dzikim typem.,.,. lub. transfekowano do komórek HEK293. Komórki hodowano na sześcio-studzienkowych płytkach do hodowli tkankowej i transfekowano przy użyciu polietylenoiminy. Ekspresję powierzchniową AChR mierzono przez nałożenie komórek w PBS zawierającym 10 nM 125I-p-bungarotoksyny (125I-p-BuTx) i mg / ml BSA przez godzinę. Komórki przemyto czterokrotnie PBS i usunięto z płytki w 60 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5 mM fluorku fenylometylosulfonylu i 1,25% Triton X-100, i ilość związanej 125I. -. – Ustalono BuTx. Wiązanie 125I -. – BuTx do. podjednostkę A zawierającą powierzchnię AChR ustalono metodą immunoprecypitacji z. podjednostkowe a swoiste mAb C7 (13). Immunoprecypitacja za pomocą. podjednostkową a specyficzną surowicę poliklonalną zastosowano do określenia całkowitego wiązania komórek 125I-a-BuTx w ekstraktach Triton X-100 z HEK293 transfekowanych. cDNA (14). Poziomy wiązania 125I -. – BuTx w ekstraktach i komórki transfekowane E59K zostały określone, a następnie równe ilości zostały użyte w immunoprecypitacji przy użyciu wzrastających stężeń 125I-p-BuTx. Nagrania i analizy nagrań z łatami. Nagrania wykonano w konfiguracji z wiązaniem komórkowym (15) w temperaturze 20-22 ° C. Komórki kąpano w roztworze zawierającym 150 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 2 mM MgCl2, mM CaCl2, 10 mM glukozy; i 10 mM HEPES / NaOH (pH 7,4). Roztwór pipetowy zawierał powyższy bufor bez glukozy, ale z ACh. Prądy jednokanałowe wzmacniano wzmacniaczem Axopatch 200B (Axon Instruments Inc., Foster City, Kalifornia, USA), próbkowano na dysku twardym przy 90 kHz, początkowo filtrowano przy 9 kHz (. 3 dB, filtr Bessela). Dane dalej filtrowano do analizy do końcowej skumulowanej częstotliwości narożnej (fc) 4,37 kHz z rozdzielczością ustawioną na 45 mikrosekund. Nagrania wykonano z potencjałem pipety ustawionym na +80 mV. Przejścia kanałów wykryto za pomocą 50% progów amplitudowych (pClamp6). Aktualna amplituda została oszacowana przez skonstruowanie histogramów całopunktowych z dobrze zdefiniowanych pełnych otworów, dopasowanych przez maksymalne logarytmiczne prawdopodobieństwo dwóch funkcji Gaussa. Wybuchy zdefiniowano jako grupy otworów oddzielone okresami zamkniętymi dłuższymi niż czas krytyczny (tcrit); tcrit został wybrany tak, aby równe liczby krótkich i długich przedziałów były błędnie klasyfikowane (16). Histogramy czasu trwania impulsu dopasowano do sumy wykładników według maksymalnego logarytmu. W stężeniach między 10 a 500 .M aktywność AChR występowała w skupieniach poszczególnych otworów kanałowych, umożliwiając w ten sposób oszacowanie prawdopodobieństwa otwarcia kanału przy różnych stężeniach ACh. Klastry zdefiniowano jako grupy otworów oddzielonych okresem dziesięciokrotnie dłuższym niż przeważająca (interburst) populacja zamkniętego przedziału dla każdej badanej łaty (około 0,1. 10 milisekund)
[hasła pokrewne: aparat ortodontyczny nfz, lks pielgrzymowice, leczenie żylaków kończyn dolnych ]
[hasła pokrewne: aparat ortodontyczny nfz, herbata z miodem i cytryną, arbuz indeks glikemiczny ]