Skip to content

Rodzinna izolowana niedoczynność przytarczyc spowodowana mutacją w genie dla czynnika transkrypcyjnego GCMB cd

3 miesiące ago

707 words

Produkty rozdzielano na 1% żelu (SeaKem, FMC Corp., Rockland, Maine, USA), przenoszono na membrany nylonowe i hybrydyzowano z znakowanymi radioaktywnie genomowymi sondami GCMB technikami opisanymi poprzednio (29). Analiza markerów mikrosatelitarnych. Proste polimorfizmy powtórzenia sekwencji analizowano za pomocą markerów D6S289 i D6S422 (z zestawu mapowania Perkin-Elmer Applied Biosystems), D6S1006 (z zestawu mapującego Webera v.6) i D6S470, D6S1721 i D6S1653 (z mapy chromosomu 6 na http : //cedar.genetics.soton.ac.uk/pub/chrom6/map) z GCTTCT dodanym do 5. zakończenia każdego startera odwrotnego, aby pomóc wyeliminować problemy związane z powtórzeniami dinukleotydów. W przypadku D6S470, D6S1721, D6S1653, trzy różne allele zostały rozwiązane w probandzie, rodzicach i trzech normalnych kontrolach. W przypadku D6S1006 zaobserwowano trzy allele, a dla D6S289 zaobserwowano cztery allele. Wyniki Aby przeanalizować gen GCMB pod kątem możliwych mutacji, najpierw ustaliliśmy intron-eksonową organizację genu. Gen obejmuje w przybliżeniu 15 kb i zawiera 5 eksonów w oparciu o porównanie z ludzką sekwencją cDNA (21, 23) (Figura 2). Dla porównania, mysi gen Gcm2 składa się tylko z czterech egzonów (22, 25). Miejsce startu transkrypcji i kodon translacji-inicjatora są obecne w eksonie 1, a kodon terminacji jest obecny w eksonie 5. Otwarta ramka odczytu genu jest zgodna z sekwencją cDNA GCMB i koduje przewidywany peptyd o 506 aminokwasach. . Figura 2 Gen GCMB. (a) Mapa restrykcyjna EcoRI ludzkiego genu GCMB, z przybliżonymi odległościami genomowymi między miejscami restrykcyjnymi. (b) Genomową organizację ludzkiego genu GCMB, z eksonami (5, wskazanymi przez ramki i introny wskazane przez łączące się linie. Liczby powyżej każdego egzonu wskazują odpowiednią liczbę nukleotydową sklonowanego cDNA. (c) Obszar genu usunięty w allelu. GCMB. (d) cDNA, z 5. i 3. nieulegające translacji regiony (UTR) i otwarta ramka odczytu, która przewiduje białko o 506 aminokwasach. W naszych wstępnych analizach używaliśmy starterów oligonukleotydowych odpowiadających egzonom i 2 genu GCMB do amplifikacji genomowego DNA od propositus i trzech innych pacjentów z izolowaną niedoczynnością przytarczyc (ryc. 3). Figura 3 pokazuje, że produkty o oczekiwanych rozmiarach (i odpowiednich sekwencjach) zostały wygenerowane dla pacjentów 1, 3 i 4, ale nie wygenerowano żadnego specyficznego produktu dla pacjenta 2 (propositus, podmiot IV-2 na Figurze 1). Przeciwnie, PCR genomowego DNA od rodziców osobnika 2 dawał normalne produkty zarówno dla eksonu jak i 2 (nie pokazano). Analiza PCR eksonów 3 do 5 genu GCMB wykazała amplifikację normalnych produktów dla obojga rodziców, ale tylko produkt eksonu 5 dla probanda (Figura 4), co sugeruje, że eksony 1. 4 zostały usunięte. Aby wykluczyć możliwość, że zanieczyszczające substancje hamują amplifikację eksonów do 4, przeprowadziliśmy doświadczenia mieszania, w których przeprowadzono PCR z próbkami zawierającymi równe ilości genomowego DNA z probanda i normalnego kontrolnego osobnika. PCR tych hybrydowych próbek dała powodzenie w amplifikacji fragmentów odpowiadających egzonom 1. 4 (dane nie pokazane). Ponadto, PCR genomowego DNA z probanda spowodował pomyślną amplifikację wielu eksonów z innych złożonych genów (np. GNAS1 i PTH), dostarczając dalszych dowodów na dużą, homozygotyczną delecję części genu GCMB (. GCMB), oraz nie artefakt, stanowiły niezdolność do amplifikacji eksonów do 4 GCMB. Figura 3 Wzmacnianie eksonów i 2 przez PCR. Genomowy DNA od czterech niespokrewnionych osobników z rodzinną izolowaną niedoczynnością przytarczyc amplifikowano za pomocą starterów oligonukleotydowych flankujących ekson (lewy panel) lub ekson 2 (prawy panel); proband przedstawiony na fig. odpowiada podmiotowi 2. Pozycje markerów masy cząsteczkowej zaznaczono po lewej stronie. DNA z osobników 1, 3 i 4 wykazało amplifikację fragmentów o odpowiedniej wielkości, podczas gdy DNA od podmiotu 2 nie powielało fragmentu odpowiadającego eksonowi lub eksonowi 2. Figura 4Amplifikacja eksonów 3, 4 i 5 za pomocą PCR. Genomowy DNA z probanda (Pt), jej ojca (F) i matki (M) oraz dwóch niespokrewnionych zdrowych osobników (NL) amplifikowano za pomocą starterów oligonukleotydowych flankujących ekson 3 (górny panel), ekson 4 (środkowy panel) lub eksonu 5 (dolny panel). Strzałki wskazują położenie odpowiednio wzmocnionego produktu o odpowiedniej wielkości. DNA z probandu (Pt) nie powielało fragmentów odpowiadających eksonom 3 i 4, ale dało odpowiedni produkt PCR odpowiadający egzonowi 5. Genomowy DNA od rodziców i dwóch normalnych osobników dało produkty PCR o odpowiedniej wielkości dla wszystkich trzech eksonów. Aby zweryfikować delecję, przeprowadziliśmy analizę endonukleazy restrykcyjnej genomowego DNA z probandu, jej rodziców i normalnych osobników kontrolnych
[więcej w: pełnia księżyca a samopoczucie, pozycja na rowerze szosowym, pierogi z mąki orkiszowej ]
[przypisy: obliczanie wskaźnika bmi, pierogi z mąki orkiszowej, pogotowie dentystyczne olsztyn ]