Skip to content

Sygnalizacja ASK1 / 2 promuje zapalenie w mysim modelu neutrofilowej dermatozy ad 5

2 miesiące ago

400 words

Uformowane w formalinie stopy zostały przetworzone i zatopione w parafinie zgodnie ze standardowymi procedurami. Skrawki (5 .m) wybarwiono hematoksyliną i eozyną (H & E). W przypadku immunohistochemii, utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie tkanki pocięto na 4. M przekroje i skrawki wybarwiono anty-Ly-6G, aby uwydatnić neutrofile w łapach, a obrazy pozyskano stosując mikroskopię świetlną. Analiza immunoblotowa. Lizaty białkowe Footpad zebrano w buforze do lizy RIPA uzupełnionym kompletnym koktajlem inhibitora proteazy (Roche) i PhosSTOP (Roche) stosując homogenizator tkanki. Próbki oceniano ilościowo przy użyciu zestawu BCA Protein Bray Assay według instrukcji producenta, a 40 .g białka rozdzielano metodą SDS-PAGE i przenoszono na membrany PVDF. Membrany zablokowano w 5% beztłuszczowym mleku i inkubowano przez noc w temperaturze 4 ° C z pierwszorzędowymi przeciwciałami. Następnie membrany sondowano drugorzędowymi przeciwciałami znakowanymi HRP w temperaturze pokojowej przez godzinę. Immunoreaktywne białka wizualizowano przy użyciu podłoża chemiluminescencyjnego Luminata Western HRP. Przeciwciała przeciwko następującym białkom otrzymano z Cell Signaling Technology: phospho-ERK1 / 2 (katalog 9101), ERK1 (katalog 9102), phospho-p38 (katalog 9211), p38 (katalog 9212), fosfo-I (B. (katalog 2859), I. B. (katalog 9242), fosfo-STAT1 (katalog 9167). Actin otrzymano z Proteintech (katalog 66009-1-IG). Poziomy cytokin in vivo. Krew pobrano przez nakłucie żyły podżuchwowej i pozostawiono do skrzepnięcia przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Surowicę zebrano po odwirowaniu i zmierzono cytokiny za pomocą testu ELISA. Lizaty białka łapy poddano obróbce w sposób opisany powyżej, a cytokiny zmierzono metodą ELISA. ELISA. Testy ELISA cytokin przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta (Milliplex). Cytometrii przepływowej. Do cytometrii przepływowej zastosowano przeciwciała CD11b (M1 / 70, Invitrogen) i Gr-1 (RB6-8C5, Biolegend). Dane z cytometrii przepływowej uzyskano w LSR Fortessa (BD Biosciences) i analizowano za pomocą oprogramowania Flowjo (Tree Star). Interferencja RNA. W przypadku RNAi komórki HEK293T (CRL-3216, ATCC) transfekowano następującymi siRNA przy użyciu Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta: zwalidowanego ludzkiego ASK1 (siRNA 1, Stealth Select RNAi MAP3K5VHS40812) i zwalidowanego ludzkiego ASK2 ( siRNA 2, Stealth Select RNAi MAP3K6VHS40537). Statystyka. Wszystkie wyniki są przedstawione jako średnie. SEM. Krzywe choroby analizowano, przeprowadzając test logarytmiczny Mantel-Cox, a istotne różnice między 2 grupami określano za pomocą testu U Manna-Whitneya. Analizę statystyczną między próbami przeprowadzono przy użyciu dwustronnego testu Studenta i dwuczynnikowej ANOVA dla wielokrotnych porównań. Całą analizę przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Graphpad Prism (wersja 7.0). Różnice uznawano za istotne statystycznie, gdy P <0,05. NS, nieistotne. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001. Zatwierdzenie badania. Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee z St. Jude Children s Research Hospital, Memphis, TN. Wpłaty od autorytetów ST, PG i TDK zaprojektowały i skonstruowały studium. ST, AB, TKD i PG przeprowadzili eksperymenty. ST przeanalizował dane i napisał manuskrypt z danymi innych autorów. TDK nadzorował projekt. Materiały uzupełniające Zobacz Dodatkowe dane Podziękowania Niniejsza praca została wsparta grantami dla TDK od NIH (CA163507, AR056296, AI124346 i AI101935) oraz amerykańskich libańskich stowarzyszonych organizacji charytatywnych (ALSAC). Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J Clin Invest. 2018; 128 (5): 2042. 2047.https: //doi.org/10.1172/JCI98446. [przypisy: olza pogwizdów, pogotowie dentystyczne olsztyn, arbuz indeks glikemiczny ] [patrz też: herbata z miodem i cytryną, arbuz indeks glikemiczny, odklejenie siatkówki oka ]