Skip to content

Tetramery MHC klasy II identyfikują specyficzne dla peptydu ludzkie limfocyty T CD4 + proliferujące w odpowiedzi na antygen grypy A cd

1 miesiąc ago

756 words

PBMC od tego samego DRB1 * 0401, DRB1 * 0101 osobnika, z którego otrzymano klona, a drugą osobnika (DRB1 * 0401, * 0401) oddzielono od heparynizowanej krwi żylnej przez wirowanie w gradiencie (Lymphoprep; Nycomed Pharma AS Diagnostics, Oslo, Norwegia ). Komórki hodowano w RPMI-1640 (GIBCO BRL, Rockville, Maryland, USA), z dodatkiem 2 mM L-glutaminy, mM pirogronianu sodu, 100 | ig / ml penicyliny / streptomycyny i 15% objętościowo połączonej surowicy ludzkiej. Komórki adherentne przygotowano przez wysianie PBMC w ilości 5 x 106 komórek na studzienkę w 24-studzienkowych płytkach przez godzinę. Nieprzylegające komórki usunięto za pomocą pipety do przenoszenia. Komórki adherentne inkubowano przez 3 godziny z 10. G / ml peptydu HA307. 319, całą szczepionką przeciw grypie zawierającą 11. G / ml HA (Connaught Laboratories Inc., Swiftwater, Pennsylvania, USA) lub maksymalnie stymulującą dawką całego tężca. toksoid. Frakcję nieprzylegającą przepuszczono przez kolumnę z wełny nylonowej, przemyto dwukrotnie PBS bez surowicy i wybarwiono ester sukcynimidylowy dioctanu 0,8. M 5- (i -6) -karboksyfluoresceiny (CFSE, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) dla 10 minut w 37 ° C. Barwienie zatrzymano przez dodanie 100% FBS, a następnie dwukrotne przemycie komórek w pożywce hodowlanej RPMI-1640. Komórki T oczyszczone przy użyciu null wełnianych barwionych CFSE następnie dodano z powrotem do adherentnych komórek przy gęstości 2,5 x 106 komórek na studzienkę. Po 7 dniach hodowli, komórki zabarwiono tetramerem znakowanym PE i kombinacjami znakowanych fluorochromem anty-CD3,.-CD4, -CD8 i -CD25 (PharMingen, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, California, USA) jako opisane powyżej i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Obliczanie podziałów komórkowych i częstotliwości prekursorów. Część wybarwionych CFSE komórek stymulowano 2,5 ug / ml fitohemaglutyniny (PHA) i 10 U IL-2 i badano FACS w dniu 7. Poliklonalna stymulacja komórek T za pomocą PHA i IL-2 prowadzi do podziału komórkowego z wyraźnym Piksele fluorescencyjne CFSE, umożliwiające określenie średniej fluorescencji CFSE dla każdego pokolenia. Wartości te wykorzystano do obliczenia średniej liczby podziałów komórkowych w komórkach stymulowanych antygenem. Częstotliwość prekursorów oszacowano dzieląc liczbę komórek pozytywnych względem tetrameru 2x, gdzie x oznacza średnią liczbę podziałów komórkowych, w celu określenia bezwzględnej liczby prekursorów komórek pozytywnych względem tetrameru, a następnie dzieląc tę wartość przez całkowitą liczbę komórek komórki poddane analizie. Wyniki i dyskusja Wcześniejsze badania wykazały, że limfocyty krwi obwodowej od osób z wcześniejszą ekspozycją na wirusa grypy A generują odpowiedź proliferacyjną komórek T zależną od DR ograniczoną do klasy II do epitopu HA307A 319 (19). Ten konserwatywny peptyd może indukować odpowiedź proliferacyjną w wielu różnych haplotypach DR, w tym DR1, DR4, DR5 i DR7 (20). W celu wykrycia limfocytów T specyficznych dla peptydu HA307A 319 przedstawionego w kontekście DR4, zsyntetyzowaliśmy tetramery klasy DRA1 * 0101 / DRB1 * 0401 obciążone peptydem HA307A 319. Testowaliśmy specyficzność tetrameru HA307A 319 przy użyciu klonu komórek T ludzkiego ograniczonego DRB1 * 0401 specyficznego dla HA307. 319. Jak pokazano na Figurze 1a, klon wykazał proliferację swoistą wobec antygenu wobec HA307A 319 w kontekście DRB1 * 0401 ulegającego ekspresji w linii komórkowej BLS-1 (18). Barwiliśmy specyficzny klon HA307A 319 z użyciem tetramerów DRB1 * 0401 obciążonych peptydem HA307A 319. Jak pokazano na Figurze 1b, praktycznie wszystkie komórki wybarwiały się pozytywnie dla tetrameru HA307A 319 i CD4, zgodnie z fenotypem klonu. Jako kontrolę skonstruowaliśmy także tetramer DRB1 * 0401 naładowany peptydem TT830-843 (21). Jak zilustrowano na Figurze 1c, żadna z komórek klonalnych HA307A 319 zabarwiła się pozytywnie dla tetrameru TT830-843. Figura 1Specyficzność i ograniczenie HLA tetrameru HA307A 319. (a) Porównanie z inkorporacją tymidyny po 72 godzinach pomiędzy klonem komórek T hodowanym z BLS-1 transfekowanym DRA1 * 0101 / DRB1 * 0401 DRA1 * 0101 / DRB1 * 01 bez antygenu (lewy słupek) i 10 .g / ml peptydu HA307A 319 ( prawy pasek). Słupki błędu wskazują SEM w trzech powtórzeniach. W punktach b i c, komórki klonalne barwiono znakowanym PE tetramerem przez 3 godziny w 37 ° C, przemyto, wybarwiono anty-CD4, ponownie przemyto i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Barwienie za pomocą tetrameru obciążonego HA307a 319 pokazano na b, a tetramer obciążony peptydem TT830-843 przedstawiono w c. W obu przypadkach komórki są bramkowane na rozpraszanie do przodu i boku, oś pionowa pokazuje fluorescencję tetrameru, a oś pozioma przedstawia fluorescencję CD4. Procenty przedstawione na marginesach każdego panelu przedstawiają procent wszystkich komórek obecnych w każdym kwadrancie. Następnie przetestowaliśmy zdolność tetrameru HA307A 319 do wykrywania komórek T specyficznych względem antygenu pobranych z krwi obwodowej 2 dawców DRB1 * 0401, w tym tego samego dawcy, z którego pochodził klon specyficzny względem HA.
[podobne: co oznacza sen o zdradzie, zajęcia sportowe dla dzieci, lks beskid brenna ]
[podobne: arbuz indeks glikemiczny, odklejenie siatkówki oka, obliczanie wskaźnika bmi ]