Skip to content

Typowy polimorfizm SCN5A moduluje biofizyczne działanie mutacji SCN5A ad

3 tygodnie ago

292 words

Mutacja i polimorfizm znajdowały się w tym samym allelu dziecka z chorobą przewodzącą i jako pierwsze sugerowały bezpośrednią funkcjonalną interakcję pomiędzy powszechnym polimorfizmem i rzadką mutacją w obrębie tego samego genu. Metoda Mutageneza. Mutagenezę ukierunkowaną (T512I) przeprowadzono na cDNA SCN5A sklonowanym w pSP64T, jak opisano wcześniej (17, 18). 1795insD zmutowane i H558R wytworzono stosując zestaw do mutagenezy QuikChange z Stratagene (La Jolla, Kalifornia, USA), stosując hH1 / pCGI-WT jako matrycę. H558R / T512I i H558R / 1795insD podwójne mutanty wytworzono przez tę samą mutagenezę, stosując odpowiednio H558R-hH1 / pCGI i 1795insD / pCGI jako matrycę, do bicistronowej ekspresji białka kanałowego i reportera GFP w komórkach tsa-201 lub HEK 293. Komórki kotransfekowano przy użyciu równomolowego stosunku podjednostki ludzkiej A (1 z Na + (dostarczonej przez Al George a, Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine). Elektrofizjologia. Wszystkie prądy Na + w całych komórkach rejestrowano w temperaturze 21 ° C w celu ograniczenia błędu clamp-clamp podczas aktywacji i inaktywacji bramkowania w wyższych temperaturach. Roztwór pipetowy zawierał 10 mM NaF, 110 mM CsF, 20 mM CsCl, 10 mM EGTA i 10 mM HEPES (pH doprowadzono do 7,35 z CsOH); roztwór do kąpieli zawierał 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, mM MgCl2 i 10 mM HEPES (pH 7,35). Prądy próbkowano z częstotliwością 20 kHz za pomocą płyty analogowo-cyfrowej Digidata 1200 (Axon Instruments Inc., Foster City, Kalifornia, USA) i filtru dolnoprzepustowego przy częstotliwości 2 kHz. Dane zebrano przy użyciu pClamp 8.0.1 (Axon Instruments Inc.) i analizowano przy użyciu Clampfit (Axon Instruments Inc.). Protokoły napięciowo-zaciskowe są dostarczane jako wypustki na każdej figurze. Wyniki są wyrażone jako średnie. SEM i porównania statystyczne wykonano jednokierunkową ANOVA przy użyciu oprogramowania Origin (Microcal Software Inc., Northampton, Massachusetts, USA), przy czym P <0,05 wskazuje na istotność. Funkcje wielowykładnikowe dopasowano do danych za pomocą nieliniowej metody najmniejszych kwadratów za pomocą oprogramowania Origin. Wyniki Charakterystyka kliniczna i odkrycia genetyczne. Zbadaliśmy rodzinę, która zgłosiła się do lekarza, gdy proband, 2-latek w momencie pierwszego badania (z rodowodu patrz rysunek 1a, II-1), został oceniony na nieregularne bicie serca. Blok przedsionkowo-komorowy drugiego stopnia (AV) został wykryty i poddany stymulatorowi. Zapis EKG (ryc. 1b) pokazuje tętno w tle o wartości około 130 uderzeń na minutę (normalne dla 2-letniego). Czas trwania zespołu QRS i odstęp QT są prawidłowe. Na przepuszczonych uderzeniach odstęp PR jest względnie stabilny i wydłużony do 200. 240 ms (normalny dla wieku 2 lat wynosi mniej niż 150 ms), co sugeruje blok bloku przewodzącego typu 2 (Purkinje). Ponadto pokazane EKG (strzałka) wskazuje przerywany blokowany sygnał rytmu, ze skróceniem odstępu PR na rytmie bezpośrednio po bloku, funkcja sugerująca blok typu (AV). Rodzice i rodzeństwo mają normalny EKG (normalne odstępy QRS, PR i QT) i nie było dowodów na blok serca związany z matczynym przeciwciałem (19). Rycina Fenotyp i fenotyp EKG. (a) Rodowód pokazuje dotknięte osoby. Szare pola reprezentują polimorfizm H558R, podczas gdy czarne pola reprezentują mutację T512I. Podczas gdy ojciec (I-1) był heterozygotą pod względem H558R, matka (I-2) była heterozygotyczna pod względem H558R i T512I. Proband (strzałka, II-1) był homozygotyczny pod względem H558R i heterozygotyczny pod względem T512I, podczas gdy jego rodzeństwo (II-2 i II-3) było heterozygotami pod względem H558R. (b) EKG probanda wskazujące blok przewodzenia drugiego stopnia z normalnym czasem trwania QT i QRS. (c) Analiza sekwencji SCN5A ujawnia zmianę treoniny do izoleucyny w pozycji 512 i zmianę histydyny na argininę w pozycji 558. SCN5A oceniono jako gen kandydujący, a poszukiwano mutacji stosując bezpośrednie dwukierunkowe sekwencjonowanie regionu kodującego. Analiza sekwencji wykazała zmianę cytozyny na tyminę (C1535T), co spowodowało zmianę aminokwasu z treoniny do izoleucyny (T512I) w kodonie 512 i zmianę adeniny na guaninę (A1673G), co spowodowało zmianę aminokwasu z histydyny na arginina (H558R) w kodonie 558 (Figura 1c). Zmiana nukleotydowa C1535T tworzy unikalne miejsce restrykcyjne BstF5I, podczas gdy zmiana nukleotydowa A1673G tworzy miejsce restrykcyjne AciI, umożliwiając niezależne potwierdzenie obu zmian sekwencji (T512I i H558R). Ojciec był heterozygotą pod względem H558R, podczas gdy matka była heterozygotyczna pod względem H558R i T512I z obiema zmianami sekwencji na tym samym allelu. Proband (Figura 1a, II-1) był homozygotyczny pod względem H558R i heterozygotyczny pod względem T512I [więcej w: przedszkole strumień, co oznacza sen o zdradzie, rezonans magnetyczny poznan ] [podobne: nalewka z aronii liście wiśni, co oznacza sen o zdradzie, pełnia księżyca a samopoczucie ]