Skip to content

Typowy polimorfizm SCN5A moduluje biofizyczne działanie mutacji SCN5A cd

2 tygodnie ago

821 words

Jego rodzeństwo było heterozygotyczne wobec H558R i nie nosiło T512I. Aby zweryfikować, że polimorfizm i mutacja były na tym samym allelu, ekson 12 (z probandu) amplifikowano metodą PCR i subklonowano za pomocą metody klonowania TA (Invitrogen Corp., San Diego, California, USA). Cztery poszczególne klony oceniano następnie przez trawienie restrykcyjne BstF5I i AciI; dwa klony zawierały zarówno T512I, jak i H558R (odziedziczone po matce), a dwa zawierały H558R (odziedziczony po ojcu). T512I i H558R: konkurencyjne efekty dla bramkowania zależnego od napięcia. Ekspresjonowaliśmy kanały SCN5A typu dzikiego, T512I i H558R w komórkach tsa-201, aby umożliwić pomiary napięcia całkowitego w komórce. Figura 2c pokazuje typowy prąd Na + (INa) zarejestrowany podczas depolaryzacji krokowej do> 20 mV z potencjału utrzymującego wynoszącego> 120 mV. Mierzyliśmy szczyt INa przy różnych napięciach aktywujących (wstawka protokołu, rysunek 2b) i po stopniowaniu kondycjonującym do zakresu napięć inaktywujących (wstawka protokołu, Figura 2a). Zależność napięciową aktywacji (okręgi) i inaktywację (kwadraty) dla symboli typu dzikiego (symbole wypełnione) i H558R (symbole otwarte) wykreślono (Figura 2a), a parametry zależne od napięcia uzyskano przez dopasowanie funkcji Boltzmanna do danych. (Tabela 1). W szerokim zakresie potencjałów błony aktywacja i dezaktywacja kanałów typu dzikiego i H558R była podobna. W przeciwieństwie do tego zależność napięciowa aktywacji (otwarte trójkąty na Fig. 2b) i inaktywacja (wypełnione trójkąty na Figurze 2b) T512I została przesunięta ujemnie o 8. 9 mV (Tabela 1). Ponieważ proband był heterozygotyczny pod względem T512I i homozygotyczny pod względem H558R, badaliśmy także bramkowanie podwójnego mutanta H558R / T512I. Figura 2b pokazuje aktywację (wypełniony diament) i inaktywację (otwarty diament) konstruktu H558R / T512I. Niespodziewanie, H558R wyeliminował negatywne przesunięcie w aktywacji i inaktywacji. Rysunek 2 Parametry bramkowania w stanie ustalonym. (a) Zależność napięciowa aktywacji i inaktywacji typu dzikiego i H558R uzyskana z wykorzystaniem protokołów pokazanych w wypustce i dopasowanych do funkcji Boltzmanna. (b) Parametry aktywacji i inaktywacji typu dzikiego, T512I i H558R / T512I dopasowanego do funkcji Boltzmanna. Zwróć uwagę na hiperpolaryzujące przesunięcia w krzywych aktywacji i dezaktywacji w wyniku mutacji, a także ich przywrócenie przez H558R. (c) Stany przejściowe typu dzikiego i T512I INa otrzymane podczas depolaryzacji do a20 mV z potencjału podtrzymującego . 120 mV znormalizowano w celu zilustrowania podobieństwa w szybkiej inaktywacji. Tabela Zależność napięciowa aktywacji i inaktywacji Zwiększona inaktywacja i choroba przewodzenia. Biorąc pod uwagę, że polimorfizm całkowicie korygował wywołany przez T512I wpływ na zależność bramkowania od napięcia, rozważaliśmy, czy resztkowe zmiany kinetyczne w H558R / T512I mogą wyjaśnić obserwowany fenotyp powolnej przewodzenia. Po depolaryzacji kanały Na + szybko się otwierają i szybko ulegają dezaktywacji. w ciągu kilku milisekund, powodując przejściowy prąd wewnętrzny. Aby ustalić, czy szybkość szybkiej inaktywacji bramek została zmodyfikowana przez mutację, porównaliśmy rozpad dzikiego typu i T512I INa po depolaryzacji krokowej, aby zbadać potencjały w zakresie od ~ 40 mV do 0 mV. Figura 2c pokazuje reprezentatywne nagrania INa z kanałów typu dzikiego i T512I podczas depolaryzacji schodkowej z potencjału utrzymującego od> 120 mV do> 20 mV. Przy wszystkich testowanych napięciach szybkość zaniku była podobna. Ostatnie badania wykazały rolę patofizjologiczną dla wolniejszych kinetycznych składników inaktywacji, które rozwijają się w czasie trwania potencjału czynnościowego serca i opóźniają powrót do stanu sprawności po dezaktywacji między uderzeniami serca (5, 6, 20). W zespole Brugadów, wzmocniony. Wolno. inaktywacja znacząco opóźnia odzyskanie kanałów Na + między bodźcami, powodując skumulowaną utratę funkcji, szczególnie przy szybkich częstości akcji serca ze względu na skrócone czasy rozkurczowe (5). Przeanalizowaliśmy powolną inaktywację mutantów T512I przy użyciu protokołu z podwójnym impulsem do naśladowania kolejnych bodźców (wstawka, rysunek 3b). Wraz ze wzrostem czasu trwania pierwszego impulsu depolaryzacji (P1) zwiększył się zakres powolnej inaktywacji, na co wskazuje obniżenie wartości szczytowej INa podczas impulsu P2 w stosunku do tego zarejestrowanego w impulsie P1. 20-ms repolaryzacja do p 120 mV została wstawiona pomiędzy P1 i P2, aby umożliwić odzyskanie z szybkiej, ale nie powolnej inaktywacji. Figura 3a pokazuje, że wraz ze wzrostem czasu trwania P1, prąd wywołany przez impuls P2 zmniejszył się z powodu powolnej inaktywacji. W przypadku typu dzikiego zakres powolnej inaktywacji był podobny do wcześniej opublikowanych wyników (21). W przeciwieństwie do tego, T512I znacznie zwiększył rozwój powolnej inaktywacji (Figura 3a), podczas gdy H558R nie zmienił stopnia, w jakim rozwinęła się powolna inaktywacja (Figura 3b)
[przypisy: zajęcia sportowe dla dzieci, aparat ortodontyczny nfz, naturalne barwniki do jajek ]
[przypisy: zajęcia sportowe dla dzieci, rezonans magnetyczny poznan, naturalne barwniki do jajek ]