Skip to content

Zewnątrzkomórkowy wapń wywołuje odpowiedź chemokinetyczną z monocytów in vitro i in vivo ad

1 miesiąc ago

691 words

Jednak fizjologiczna rola CaR w komórkach jednojądrzastych jest nieznana. Zbadaliśmy, czy jon wapniowy jest czynnikiem chemokinetycznym dla ludzkich monocytów, czy ta aktywność zachodzi za pośrednictwem CaR sprzężonego z białkiem G i czy interakcje z innymi czynnikami chemokinetycznymi są indukowane przez aktywację CaR. Oceniliśmy in vivo konsekwencje aktywacji CaR i zanotowaliśmy znaczną infiltrację monocytami. Dane te silnie wspierają rolę pozakomórkowego wapnia w modulowaniu lokalizacji monocytów i sugerują jon wapnia jako prymitywnego mediatora funkcji odpornościowej. Metody otrzymywania CD14 + PBMC. Komórki o niskiej gęstości wyizolowano z ludzkiej i mysiej krwi obwodowej przy użyciu Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, New Jersey, USA). Monocyty CD14 + oczyszczono przez sortowanie na FACSVantage (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, California, USA), w oparciu o ekspresję CD14. Oczyszczone komórki inkubowano w pożywce wolnej od wapnia (1 x HBSS, Mediatech Inc., Herndon, Virginia, USA) lub zmodyfikowanej pożywce Dulbecco. 1. Iscove. (IMDM) (Mediatech Inc.), która zawierała 1,5 mM Ca2 + . Pożywkę następnie uzupełniano 0,5 mM, mM, 2 mM, 3 mM lub 5 mM CaCl2 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) w celu osiągnięcia pożądanego poziomu wapnia pozakomórkowego lub 1. M selektywnego aktywatora CaR NPS R-467 lub jego mniej aktywnego stereoizomeru, NPS S-467, w 3 mM Ca2 +. Komórki inkubowano do 24 godzin w 5% CO2 nawilżonym powietrzu. Monocyty następnie odłączono od płytki za pomocą skrobaczki do komórek. Wszystkie stężenia wapnia przedstawione w przedstawionych danych przedstawiają całkowity Ca2 + w podłożu podstawowym plus dodany Ca2 +. Testy transmigracji. Transwells (membrana poliwęglanowa o średnicy porów 5 .m, średnica 12 mm) (Corning-Costar Corp., Nowy Jork, Nowy Jork, USA) wykorzystano do oceny migracji komórek przy użyciu ustalonej metodologii (25). Stężenie Ca2 + w IMDM w górnej i dolnej komorze Transwell. zostały dostosowane zgodnie z analizą chemotaksji w szachownicy. Stężenia wapnia wahały się od 0. 6,5. M. Oczyszczone monocyty (104) umieszczono następnie w górnej komorze z 150 ul IMDM. Pięćset mikrolitrów pożywki dodano do dna studzienki i uzupełniono zmiennymi stężeniami Ca2 + lub Ca2 + plus 10 ng / ml MCP-1, 100 ng / ml SDF-1 (3 lub 10 ng / mL MIP-1. (PeproTech Inc., Rocky Hill, Nowy Jork, USA). Komórki inkubowano w 37 ° C przez 3 godziny. W celu zbadania hamowania chemotaksji komórki inkubowano następnie z wortmaniną (1 .M przez 20 minut w 37 ° C), zie- mycyną (1 .M przez 20 minut w 37 ° C) lub genisteiną (1 .g / ml przez 20 minut). w 37 ° C) przed ich użyciem w testach transmigracyjnych. Pod koniec eksperymentu komórki zebrano z dolnej komory i zliczono za pomocą hemocytometru. Cytosolicowe zmiany wapnia. Oczyszczone monocyty obciążono Indo-1 AM (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA). Komórki zebrano na urządzeniu FACSVantage. przez 30 sekund w celu ustalenia wyjściowej wartości emisji dla Indo-1 AM. Ligandy chemokinowe następnie dodano do komórek inkubowanych w pożywce wolnej od Ca2 + lub uzupełniono 1,5 mM lub 4,5 mM CaCl2 i albo selektywnym aktywatorem receptora wapnia NPS R-467 lub mniej aktywnym NPS S-467 (1. M) (prezent z E. Nemeth, NPS Pharmaceuticals Inc., Salt Lake City, Utah, USA). Następnie akwizycja danych trwała do 5 minut. Ekspresja receptora chemokin i analiza cytometrii przepływowej. Oczyszczone monocyty inkubowano w pożywce pozbawionej Ca2 + uzupełnionej mM, 3 mM lub 5 mM CaCl2, lub z 1,5 mM CaCl2 plus M NPS R-467 lub NPS S-467. Komórki płukano raz w PBS z 1% FCS, a następnie ponownie zawieszano w 100 .l wolnego od Ca2 + PBS. Przeciwciała monoklonalne przeciwko CaR dodano do komórek i inkubowano je samodzielnie lub z peptydem CaR przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Komórki przemyto PBS zawierającym 1% FCS, ponownie zawieszono w PBS z 1% FCS i inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej ze skoniugowanym z FITC anty-mysim IgG. Komórki ponownie przemyto i dodano skoniugowane przeciwciało monoklonalne i inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Zastosowano przeciwciała monoklonalne anty-CXCR4, anty-CCR5 (PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA), anty-CCR2 (R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA), anty-CD14 i anty-CD4 (immunocytometria Becton Dickinson). Systemy). Zabarwione komórki utrwalono 1% paraformaldehydem i oznaczono w ciągu 24 godzin. Przeprowadzono analizę cytometrii przepływowej przy użyciu podwójnego lasera FACSCalibur skalibrowanego za pomocą 2. M kuleczek CaliBRITE (oba z systemów immunocytometrycznych Becton Dickinson)
[podobne: co oznacza sen o zdradzie, aparat ortodontyczny nfz, rezonans magnetyczny poznan ]
[patrz też: lks strażak pielgrzymowice, wisła strumień, lks pielgrzymowice ]