Skip to content

Zewnątrzkomórkowy wapń wywołuje odpowiedź chemokinetyczną z monocytów in vitro i in vivo cd

2 tygodnie ago

82 words

Akwizycję i analizę danych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania CellQuest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Hodowla i genotypowanie CasR. /. myszy. CasR. /. myszy były hodowane jak opisano wcześniej (19). Aby wyprodukować CaR. /. myszy do tego badania, heterozygotyczne myszy były skrzyżowane. Badane myszy miały mieszane tło genetyczne 129S6 / SvEv lub 129S6 / SvEv / Swiss Webster. (Myszy homozygotyczne pod względem allelu nokautu CaR nie żyją dłużej niż 3 tygodnie.) Myszy genotypowano, stosując następujący protokół. Próbkę DNA (1 pi) uzyskano z sekcji (<5 mm) ogona każdej myszy, która ma być genotypowana zgodnie z ustalonymi technikami (19). W ten sposób otrzymano genotypy myszy CaRa / a, CaR + / a i CaR + / +. Krew obwodową uzyskano od myszy każdego genotypu w chwili uśmiercenia w dniu 6. 8 po urodzeniu. Aktywność biologiczna wapnia jonowego in vivo. Myszy C57BL / 6 (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA) wstrzyknięto podskórnie w zaznaczonym, ogolonym miejscu na brzuchu z 20 ul 5 mM CaCl2 lub 20 ul MCP-1 w stężeniu 10 ng. / mL, z kombinacją MCP-1 i 5 mM CaCl2 lub 10 (M NPS R-467 w PBS. Myszy kontrolne wstrzyknięto podskórnie samym 20 .l PBS. Wszystkie wstrzyknięte podskórnie środki zawierały mniej niż 0,004 ng / ml LPS przez test limuzynowy (Sigma Chemical Co.), jak opisano wcześniej (25). Myszy uśmiercono przez uduszenie CO2 18 godzin po wstrzyknięciu i miejsca iniekcji wycięto i szybko zamrożono. Na tej podstawie otrzymano 4. M krioskrawek i wybarwiono hematoksyliną i eozyną. Przeprowadzono immunocytochemię na zamrożonych skrawkach przy użyciu skoniugowanego z alkaliczną fosfatazą przeciwciała Mac-1 (PharMingen), jak opisano poprzednio, i oceniano za pomocą mikroskopii świetlnej (25). Wyniki Mobilizacja wapnia i chemotaksja. Łącząc wyniki cytometrii przepływowej z naszymi wcześniejszymi danymi wykazującymi obecność mRNA i białka CaR w monocytach za pomocą RT-PCR i analizy Western, wykazaliśmy, że CaR ulega ekspresji na powierzchni komórek PBMC (Figura 1a). Następnie zbadaliśmy funkcjonalne znaczenie CaR w monocytach. Zewnątrzkomórkowy Ca2 + zwiększał stężenie cytozolowego Ca2 + w sposób zależny od dawki, z maksymalną odpowiedzią przy 4,5 mM Ca2 + (Figura 1b), zgodną ze znaną zdolnością receptora do zwiększania poziomu wapnia cytozolowego przez aktywację fosfolipazy C. Figura (a) CD14 + monocyty wybarwiają się dodatnio na CaR, a wiązanie przeciwciała anty-CaR jest hamowalne przez preinkubację z peptydem CaR. Oczyszczone CD14 + PBMC (scattergram: oś pionowa to logarytmiczna fluorescencja ze skoniugowanym allofikocyjaninem anty-CD14, oś pozioma to rozproszenie boczne) eksponowano na przeciwciało anty-CaR (prawy panel, stały histogram) lub kontrolę izotypową (otwarty histogram) i badano przepływowo cytometria. Monocyty były również preinkubowane z peptydem CaR przed barwieniem przeciwciałem anty-CaR (histogram przerywany). Oś wirtualna to liczba zdarzeń; Oś pozioma to fluorescencja logarytmiczna ze skoniugowanym z izotiocyjanianem fluoresceiny anty-CaR. Dane stanowią jedno z dziesięciu niezależnych eksperymentów o porównywalnych wynikach. (b) Podniesienie pozakomórkowego stężenia Ca2 + lub dodanie selektywnego aktywatora CaR NPS R-467 indukuje podwyższenie stężenia Ca2 + w cytozolu. Trwały wzrost poziomu Ca2 + w cytozolu obserwowano w odpowiedzi na 4,5 mM Ca2 + lub .M NPS R-467 lub S-467 w obecności 1,5 mM Ca2 +. Wszystkie przedstawione stężenia wapnia przedstawiają całkowitą zawartość wapnia w podłożu podstawowym plus dodany wapń. Dane pochodzą z jednego z trzech niezależnych eksperymentów o podobnych wynikach. Następnie przeprowadzono test transmigracji w celu ustalenia, czy wapń był zdolny do wywoływania chemotaksji monocytów. Zaobserwowano zależny od dawki efekt, przy maksymalnej chemotaksji obserwowanej przy 4,5 mM Ca2 + w analizie szachownicy w odpowiedzi chemotaktycznej na gradient stężenia jonów wapnia. Chemotaksja była hamowalna przez toksynę krztuścową i przez inhibitory kinazy tyrozynowej, herbimycynę i genisteinę, ale nie przez inhibitor kinazy PI-3, wortmaninę (Figura 2, aib). Rola CaR w tych odpowiedziach była dalej oceniana przez ekspozycję komórek na sperminę, polikationowego agonistę CaR (26) i selektywny aktywator CaR NPS R-467 lub jego mniej aktywny stereoizomer, NPS S-467 (21, 27). Stymulowanie cytosolicowych odpowiedzi wapnia i transmigrację odnotowano dla każdego z tych środków. Większa siła działania R-467 niż S-467 w zwiększaniu działania wysokiego Ca2 + na te dwie odpowiedzi biologiczne jest całkowicie zgodna z ich znanymi działaniami farmakologicznymi na klonowanym CaR i silnie wspiera rolę receptora w pośredniczeniu w tych działaniach pozakomórkowy Ca2 + na monocytach (21) (Figura 2c). Figura 2 Mukocyty migrują w kierunku Ca2 + w sposób zależny od dawki, który jest hamowalny przez wstępne traktowanie toksyną krztuścową, genisteiną lub herbimycyną, i jest wzmacniany przez selektywny aktywator CaR NPS R-467 i chemokinę MCP-1. [patrz też: olza pogwizdów, obliczanie wskaźnika bmi, strażak pielgrzymowice ] [hasła pokrewne: lks beskid brenna, przedszkole strumień, olza pogwizdów ]